Tissue-on-a-Chip: Microphysiometry With Human 3D Models on Transwell Inserts

微生理測量已被證明是用于監(jiān)測活細胞能量代謝以及細胞間相互作用的有利工具，該技術(shù)之前主要用于監(jiān)測二維細胞層。最近，我們的研究小組發(fā)現(xiàn)，微生理測量也可以自動檢測皮膚3D培養(yǎng)物的胞外酸化速率和跨上皮電阻值(TEER)，該培養(yǎng)物是培養(yǎng)在3D打印的封閉的生物芯片之中來維持氣液界面(ALI)。在這項工作中，我們提出了一種優(yōu)化的多通道芯片用于監(jiān)測商品化的3D小腸組織模型的TEER。實驗持續(xù)1天，60分鐘為重復(fù)周期，每個周期包括三個階段：(1)維護氣液界面(ALI)；(2)加入測量培養(yǎng)基或者試驗物；(3)清洗。初始平衡8小時后，加入細胞毒性和屏障破壞的化學(xué)物質(zhì)（0.2%十二烷基硫酸鈉），導(dǎo)致TEER隨時間變化逐步降低，而以前傳統(tǒng)的細胞毒性測量方法是無法監(jiān)測到這種變化的。這項工作證實了使用自動氣液界面(ALI)的多通道實時監(jiān)測三維腸模型的TEER的可行性。培養(yǎng)的人體組織結(jié)合智能移動檢測技術(shù)，為在體外診斷提供了一個非常有前景的研究工具，特別是在毒理學(xué)，細胞代謝研究，藥物吸收等研究領(lǐng)域。

Keywords: microphysiometry, transepithelial electrical resistance, label-free monitoring, intestinal model, automated air–liquid interface

INTRODUCTION

盡管在藥物開發(fā)的臨床前階段進行了完整的試驗，但未發(fā)現(xiàn)的毒性依然是臨床階段失敗的一個常見原因（Kola and Landis, 2004; Marx et al., 2016）。藥物毒性的研究之中，重要的一點就是要考慮小腸的吸收效應(yīng)。臨床前體內(nèi)評估通常依靠小鼠或大鼠模型來代表人類特征（Le Ferrec et al.， 2001）。然而，嚙齒動物模型不能可靠地預(yù)測藥物對于人體的各個方面的效應(yīng)，所以就可能出現(xiàn)對藥物毒性或再吸收的錯誤評估。因此，近年來的研究重點已轉(zhuǎn)移到改善體外毒性研究。

在體外研究可重復(fù)性和分離影響變量的能力（Ferrick et al., 2008），有助于更好地理解毒性機制。但是2D細胞培養(yǎng)和細胞系（Leonard et al., 2010; Ayehunie et al., 2018）有限的生理相關(guān)性和細胞培養(yǎng)實驗中缺乏全自動分析的問題已經(jīng)在之前的文獻中討論過（Gómez-Sj?berg et al., 2007; Meyvantsson et al., 2008; Li et al.,2013）。 3D細胞培養(yǎng)領(lǐng)域的最新進展解決了這些局限性，并提供了新的模型來增強對新藥安全性和有效性的信心（Fang and Eglen, 2017; Park et al., 2018）。采用“組織芯片"方法，通過體外培養(yǎng)的組織和器官模型，來改進對吸收、分布、代謝和排泄（ADME）的評估（Madden et al., 2018）。

從結(jié)腸（大腸）癌中提取的Caco-2單層細胞是一種廣泛應(yīng)用于體外藥物吸收和毒性評估的細胞系，它可以代表三個吸收途徑：跨細胞（細胞內(nèi)途徑）、細胞間（細胞外途徑）和載體轉(zhuǎn)運。但是，細胞系和小腸組織的相關(guān)性有限。文獻中（Shah et al., 2006）已經(jīng)描述，它只能預(yù)測跨細胞（細胞內(nèi)途徑）滲透。此外，貼壁培養(yǎng)的單層Caco-2培細胞缺乏細胞-細胞和細胞-細胞外基質(zhì)的相互作用，不能模擬人小腸的多層復(fù)雜結(jié)構(gòu)。為了克服這種生理相關(guān)性的不足，科學(xué)家開發(fā)了新的三維重建人體組織模型（Li et al., 2013; Ayehunie et al., 2018）。在空氣-液體界面（ALI）上培養(yǎng)三維小腸器官模型，彌補了體外培養(yǎng)的2D的形態(tài)學(xué)缺陷（Nossol et al.，2011）。

使用體外組織培養(yǎng)進行藥物效應(yīng)分析的常用方法需要很多重復(fù)的組織樣本，還有繁瑣復(fù)雜的實驗步驟。方法和測量的復(fù)雜性導(dǎo)致需要大量的人工以及細胞或組織相關(guān)的硬件設(shè)備，而這些又有可能導(dǎo)致細胞損傷，增加結(jié)果的誤判（Blume et al.， 2010）。

相對手動測試，實時自動分析細胞存活率是一種更優(yōu)化的測量吸收和毒性的方案。此外，有了實時監(jiān)測的數(shù)據(jù)，就可進行短期和長期的分析。對于長期的監(jiān)測，自動化設(shè)備取代人工更換培養(yǎng)基和添加試劑，以提高實驗的通量和重復(fù)性（Kempner and Felder, 2002）?？傊瑢毎囵B(yǎng)進行實時連續(xù)測量可以同時觀察到多個細胞代謝參數(shù)，并且支持ALI培養(yǎng)的自動化微流控系統(tǒng)。我們在該研究中提出了這樣的一個測試系統(tǒng)：組織芯片（tissue-on-a-chip）結(jié)合ALI培養(yǎng)細胞（圖1）。通過生物芯片以及3D打印封閉的培養(yǎng)腔體成功培養(yǎng)了3D重建人類小腸模型。

  在這項工作中，我們提出了一個三通道、全自動的組織芯片測量系統(tǒng)（IMOLA-IVD，德國cellasys），該系統(tǒng)可以測量跨上皮細胞電阻（TEER），進一步深入了解上皮細胞層的組織形態(tài)和屏障特性。值得注意的是，與之前描述的單通道芯片系統(tǒng)相比，該系統(tǒng)在三個通道中都有一個自動的ALI，使用的細胞培養(yǎng)基更少（Alexander et al., 2018）。因此，現(xiàn)可以一次在三個的芯片上進行平行實驗，例如：測試物，對照和空白。

MATERIALS AND METHODS

Human 3D Tissue Model

實驗采用重建的三維腸組織—EpiIntestinal-FT。這個基于人體細胞的3D組織整合了腸上皮細胞、Paneth細胞、M細胞、簇細胞和小腸干細胞以及人小腸成纖維細胞，它被培養(yǎng)在ALI模擬生理條件之中。EpiIntestinal-FT模型可以用來表征小腸功能的不同方面，包括屏障功能、代謝、炎癥和毒性反應(yīng)（Ayehunie et al ., 2018）。

Microphysiometric System

德國cellasys公司的IMOLA-IVD是一個由自動化微流控系統(tǒng)擴展的微生理測量系統(tǒng)（Brischwein和Wiest, 2019）。該設(shè)備的詳細設(shè)置在之前的報告中有描述（Weiss et al.， 2013）。簡單地說，就是生物芯片上裝有兩個交叉電極結(jié)構(gòu)的電阻傳感器、兩個電化學(xué)的pH傳感器、一個電流的測氧傳感器和一個溫度傳感器。來自傳感器的測量數(shù)據(jù)被數(shù)字化記錄并傳輸?shù)接嬎銠C上的專有軟件—Data Acquisition and Link Application（DALiA）軟件。該軟件負責(zé)流體的數(shù)據(jù)的處理和流路的控制，使用一個定制化的開/關(guān)協(xié)議，以控制蠕動泵和微流控系統(tǒng)（雙向交界處的閥門）。使用這些工具可以并行監(jiān)控6通道IMOLA-IVDs同時獲得實時數(shù)據(jù)進行對比分析，例如測試物和陰性/陽性對照通道。

為了更好地使用和維護IMOLA-IVD和ALI，Alexander et al（2018）開發(fā)了一種新的封閉的培養(yǎng)腔設(shè)計，用Ultimaker 3D打印機打印的聚交酯并粘在生物芯片上。有了這種封閉的培養(yǎng)腔，就可以產(chǎn)生兩條不同的微流道：一條在培養(yǎng)腔頂端，一條是培養(yǎng)腔側(cè)面。通過一根頂端金電極和一根側(cè)面金電極傳感器可以測量在Transwell半透膜小室上培養(yǎng)的三維組織的TEER。

測量TEER的頻率為10kHz，外加電壓為30mv。結(jié)合密封腔的生物芯片和用于根尖線的射流頭如圖1所示。結(jié)合封裝的生物芯片和流路通道，如圖1所示。完整的設(shè)置如圖2所示。IMOLA suppo系rt 統(tǒng)(ISS-3)包括為IMOLA系統(tǒng)、用于控制流路系統(tǒng)的閥門的開關(guān)，以及用于記錄氣泡探測器數(shù)據(jù)的電子設(shè)備等提供電源。

DALiA客戶端軟件應(yīng)用程序用于控制測量和記錄的數(shù)據(jù)。泵、流路模塊和細胞培養(yǎng)液等IMOLA系統(tǒng)都被安裝在通用的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)，保證整個實驗都在37?C。三個通道中的每一個都有兩條流路，一條是頂端，一條是側(cè)面，如圖3所示。兩種流路都可用于將多種物質(zhì)注射到細胞環(huán)境之中，如培養(yǎng)基和測試物。在這篇文章中，頂端流路可以引入兩種不同的物質(zhì)：基礎(chǔ)培養(yǎng)基和測試物。在TEER測量過程中，在培養(yǎng)的組織的頂端加入LBM低緩沖培養(yǎng)基，從而在頂端和基底側(cè)面（液體界面）之間建立一個導(dǎo)電連接。另外，頂端覆蓋了一層薄薄的培養(yǎng)基（空氣界面）（200nm）。基底側(cè)面流路定期向培養(yǎng)的組織的基底外側(cè)注入新的營養(yǎng)物質(zhì)。在本研究中，流路系統(tǒng)的連接如圖3所示。1號閥用于更換頂端培養(yǎng)基；2號閥負責(zé)插入的培養(yǎng)小室的頂端的填充或排空；3和4號閥門分別將頂端和基底側(cè)面的培養(yǎng)基注入到生物芯片或廢液瓶中，5和6號閥門交替切換到過濾的空氣。一個IMOLA-IVD使用6個閥門和單向模式控制的4個泵通道。這里展示的裝置使用三個IMOLA-IVD模塊平行地研究三個培養(yǎng)小室（三個生物芯片，每個都有一個頂端和一個基底側(cè)面）。

Assay Preparation for Verification

為驗證流路系統(tǒng)的設(shè)置和測量，可以用磷酸緩沖液（PBS）做預(yù)實驗。對于頂端和基底側(cè)面，使用滲透壓為300±10% mOsmol/kg的PBS溶液，通過頂端通道的試驗物質(zhì)為1000±10% mOsmol/kg的PBS溶液。

Assay Preparation for the EpiIntestinalTM Model

開始前，先將組織進行預(yù)培養(yǎng)以穩(wěn)定狀態(tài)。然后注入5 ml 基底側(cè)面培養(yǎng)基 SMI-100-FT-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories)；頂端加入200 μl 的SMI-100-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories) ；然后在 37?C和5% CO2培養(yǎng)箱至少培養(yǎng)24 小時。實驗前，對整個系統(tǒng)進行滅菌和培養(yǎng)液預(yù)灌流。所有管道和頂端通過2.5%的次氯酸（Sigma Aldrich, #71696, diluted with double-distilled H2O）消毒20分鐘進行滅菌處理，生物芯片密封腔是通過浸潤在70%乙醇20分鐘進行滅菌處理。隨后，基底側(cè)面和頂端注入培養(yǎng)基，對管道進行預(yù)灌流處理。將整個系統(tǒng)和培養(yǎng)基放置在37?C和5% CO2培養(yǎng)箱之中過夜。最后，將含有小腸組織的培養(yǎng)小室放置在經(jīng)滅菌處理的生物芯片上?；讉?cè)面流路使用

SMI-100-FT-MM (MatTek In Vitro Life Science Laboratories)。頂端流路使用無緩沖DMEM (cellasys GmbH, Kronburg, Germany: SOP-G200-006; see supplement material) 和溶解在 DMEM之中的測試物。

最后使用濃度為0.2或2.0%的十二烷基硫酸鈉(SDS)作為破壞3D小腸組織屏障的物質(zhì)。在預(yù)先設(shè)定的灌流周期內(nèi)，確定了兩個流體通道的時間順序。TEER測量周期包括：35分鐘ALI，10分鐘TEER測量和15分鐘的清洗周期。第一個ALI周期用于流體系統(tǒng)的內(nèi)部預(yù)灌流，將程序設(shè)定為每個循環(huán)為1小時，持續(xù)灌流24小時。第8小時，將頂端培養(yǎng)基更換為含0.2% SDS的培養(yǎng)基，循環(huán)一個周期，然后更換為不含SDS的培養(yǎng)基。

RESULTS

Verification of the Measurement Procedure and the Fluidic System

每個TEER測量周期由測量階段和沖洗階段，循環(huán)程序的一致性可以確保整個監(jiān)測期間的變化肯定是由待測物引起的。每次TEER測量開始時，培養(yǎng)小室的頂端為空的，慢慢填充相應(yīng)的培養(yǎng)基。一旦達到足夠體積，TEER電極被浸沒在相應(yīng)的培養(yǎng)基之中，并開始夠測量電阻。使用PBS溶液進行系統(tǒng)驗證的方法如圖4。TEER的振幅的最終標準值是244Ω。隨后加入測試物，電導(dǎo)率與PBS相比有所增高，電阻的振幅的準值下降到132Ω。重新注入PBS后稀釋待測物，再吸出。如果沒有第二次注入PBS，測試物將一直保留在培養(yǎng)環(huán)境之中，持續(xù)影響細胞。如圖4所示，需要兩次清洗的循環(huán)才能除去測試物。結(jié)果表明，IMOLA-IVD裝置的灌流系統(tǒng)和傳感器的在整個測量過程之中工作正常。因此可得出結(jié)論，傳感器是精確穩(wěn)定的，振幅變化對應(yīng)于注入的PBS滲透壓的變化。

Control Experiments

為了驗證該設(shè)置，在一個IMOLA上設(shè)計了一個帶有正負對照的測試實驗。在不添加任何物質(zhì)的情況下監(jiān)測小腸組織的TEER值20小時（陰性對照），然后在2.0%SDS的影響下監(jiān)測20-28小時（陽性對照）。TEER測量每小時進行一次。在每個測量周期中，TEER值可以用

PBS測量后期的平臺期的平均值來表示，如圖4所示。這些平臺期的平均值被整合成一個連續(xù)的TEER數(shù)據(jù)圖。圖5顯示了TEER值的大小和相位（左）以及實部和虛部（右）。

TEER值通常只顯示大小,但是，為了顯示所有的測量值，測量的阻抗在兩種常用坐標系中充分顯示，即在極坐標下（左）表示大小和相位，在笛卡爾坐標下（右）表示實部和虛部。其數(shù)學(xué)表達式如公式1所示：

Tissue-on-a-Chip Model

Figure 6 加入0.2% SDS 的腸組織模型。經(jīng)過開始的5小時，TEER達到270Ω的平均值。第8小時加入測試物SDS，TEER迅速上升，隨后線性降低，在第18小時降到到225Ω。需要注意的是，SDS不會改變細胞培養(yǎng)基的滲透壓濃度。測定的0、0.2和2.0% SDS的培養(yǎng)基的滲透壓濃度 (OSMOMAT 030, Gonotec, Berlin, Germany) 基本一致(300±5% mOsmol/kg)。

CONCLUSION

在這里，我們提出了原理證明實驗使用三通道微生理測量系統(tǒng)測量重建腸上皮模型的TEER與ALI。參數(shù)的測量是非侵入性的、實時的，并且系統(tǒng)定期自動更新培養(yǎng)基。在TEER測量中，培養(yǎng)小室的頂部也注入培養(yǎng)基。PBS和2.0% SDS的驗證實驗也證實了該測量方法和系統(tǒng)。

8 h后加入測試物（0.2% SDS）后發(fā)現(xiàn)TEER呈下降趨勢。在未來的工作中，我們建議進行后續(xù)實驗，使用測試物和微傳感器來獲取pH值和溶解氧的數(shù)據(jù)(Wiest et al.，2016)。

總的來說，IMOLA-IVD系統(tǒng)已被證明是一種靈靈活、可定制的系統(tǒng)，用于分析各種細胞培養(yǎng)物模型，包括貼壁的2D細胞系，3D球狀體，以及用于重構(gòu)人類表皮和腸的組織/類器官芯片。未來的工作將包括研究和優(yōu)化灌流循環(huán)(例如，增加測試物質(zhì)之前的穩(wěn)定期的時間)和電極幾何形狀，以及光譜測量信息的收集（Gilbert et al., 2019; van der Helm et al., 2019），以建立一種可用于肺或其他粘液細胞模型的多功能的組織芯片的研究工具。

DATA AVAILABILITY STATEMENT

The datasets generated for this study are available on request to the corresponding author.

AUTHOR CONTRIBUTIONS

All authors listed have made a substantial, direct and intellectual contribution to the work, and approved it for publication